DNAを感知する

Nature Biomedical Engineering (2023)この記事を引用

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

タンパク質と核酸の間の相互作用の強度と配列特異性を単一分子で定量化できれば、タンパク質とDNAの結合の調査が容易になるでしょう。 今回我々は、触媒的に不活性なCas9リボ核タンパク質と、事前に定義された二本鎖DNAの任意の短い配列との間の結合事象が、Cas9結合二本鎖DNAオーバーハングを有する適切に設計されたバーコード化線状DNAナノ構造が移動する際のイオン電流の変化を感知することによって同定できることを示す。固体ナノ細孔を介して。 われわれは、Cas9 の DNA 配列と DNA 結合特異性、DNA 結合効率、および DNA ミスマッチ耐性との関係を一塩基レベルで研究するために、バーコード付き DNA ナノ構造を設計しました。 DNA バーコード付きナノ構造のナノポアベースのセンシングは、生物医学用途向けの効率的かつ特異的なリボ核タンパク質の設計の改善に役立つ可能性があり、高感度のタンパク質センシングアッセイに開発できる可能性があります。

タンパク質による核酸配列の認識は生物学の基礎です。 タンパク質と DNA の結合の特異性により、これらの生体分子間の相互作用は、多くのバイオセンシング ツール、生体分子工学技術、新しい治療法の基礎を形成します 1,2。 特に、クラスター化された規則的に間隔をあけられた短い回文反復配列 (CRISPR)/dCas9 システムは、診断だけでなく標的遺伝子発現のための強力なツールとして浮上しており、現在、CRISPR/Cas の効率と特異性を向上させるために多大な研究が行われています 3,4。 したがって、本来の挙動を捉えるためには、折りたたまれた状態および機能的な状態にある核酸とタンパク質の間の相互作用を分析する、シンプルで高感度なアッセイを開発することが不可欠です。 さらに、これらの方法論は、結合に劇的な影響を与える可能性がある配列内の単一ヌクレオチドの違いに敏感であることが不可欠です。

固体ナノポアを使用した抵抗パルスセンシングは、結合イベントを評価するための魅力的な方法です。 この技術は、単一のセンシング システムで DNA、RNA、タンパク質をネイティブな状態で研究できる柔軟性を提供します。 ナノ細孔センシングは、印加電場を使用して分子がナノメートル細孔を通過する際のイオン電流の変化を測定することに依存しています。 転座現象によるイオン電流の変化は、分子のサイズ、形状、電荷を反映します5。 ナノポアには、生物学的ナノポアと固体ナノポアの 2 種類があります。 生物由来のタンパク質ナノポアは DNA 配列決定に理想的に適しています 6 が、固体ナノポアは製造プロセス中に細孔サイズを制御できるため、幅広い分析物の検出が可能です。

この多用途性によりさまざまな生体分子の分析が可能になりますが、センシングの特異性の欠如は、対象のターゲットを容易に区別する必要がある多重検出にとって課題でもあります。 この障壁を克服するために、当社は DNA ナノテクノロジーを活用しています。これにより、目的のタンパク質の特異的結合部位を含むカスタム ナノ構造の設計と組み立てが可能になります 7。

この記事では、一般的な検出ツールとして使用される、ナノピペットとしても知られる石英キャピラリーを引くことによって固体ナノ細孔を作製します。 二本鎖 DNA (dsDNA) は、ナノポア信号にイオン電流降下を引き起こします。 タンパク質などの分析対象物が dsDNA に結合すると、二次電流スパイクが生成されます。 DNA 鎖に沿った特異的結合部位または配列を設計することにより、識別可能なパターンが生成されます。 この指紋は、イオン電流のスパイクの固有の痕跡として観察できます。 ナノポア内の標的ネイティブ DNA 配列の標識とマッピングは、ペプチド核酸プローブ 8,9、生化学的ライゲーション 10、転写因子 11、メチルトランスフェラーゼとビオチン化による化学修飾 12 など、さまざまな方法を使用してこれまでに達成されてきました。 最近、ナノポア分析を使用して、触媒的に不活性または死んだ Cas9 の変異体 (dCas9) の dsDNA への結合を測定することが実証されました 2,13。私たちのシステムは、ユーザー向けに設計された DNA ナノ構造を導入することにより、これらの初期の概念実証作業に基づいて構築されています。定義された DNA ターゲット検査により、ナノポアセンシング、DNA ナノテクノロジー、タンパク質と DNA の相互作用のスクリーニングの応用空間が拡大します。 今回我々は、慎重に設計してテストすると、dCas9 複合体が標識として機能し、DNA の高度に特異的なマッピングを可能にして単一塩基対の変化を決定できることを実証します。これは診断にとって特に重要です 4,14。